Осмотическая резистентность эритроцитов при постгеморрагической анемии

Тема. Нарушения системы эритроцитов.

Цель занятия. Изучить причины, механизм развития, гематологические показатели и клинические проявления различных видов анемий.

Теоретические вопросы:

1. Эритроцитозы, определение понятия, виды, клинические проявления.

2. Характеристика абсолютных и относительных, наследственных и приобретенных эритроцитозов, их этиология и патогенез.

3. Анемии, определение, принципы классификации ( по этиологии, патогенезу, типу кроветворения, цветовому показателю, регенераторной способности костного мозга, размеру и форме эритроцитов).

4. Острая постгеморрагическая анемия, этиология, патогенез, стадии, гематологические проявления.

5. Гемолитическая анемия, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

6. Железодефицитная анемия, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

7. В-12-(фолиево)-дефицитная анемия, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

8. Гипо- и апластические анемии, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

9. Клинические проявления и компенсаторно-приспособительные механизмы при анемиях.

10. Принципы диагностики и лечения анемий.

11. Осмотическая резистентность эритроцитов, определение понятия, виды.

12. Причины и механизм нарушения осмотической резистентности и скорости оседания эритроцитов, их диагностическое значение.

Работа №1. Характеристика показателей красной крови при экспериментальной гемолитической анемии.

Материальное оснащение:

Методика проведения опыта.

Гемолитическая анемия у кролика воспроизводится путем подкожного введения 1% раствора фенилгидразина солянокислого (5мг/кг) трехкратно в течение 6 дней (с двухдневным интервалом).

В день занятия из краевой вены кролика (после прокола) набирают 0,02 мл крови в пробирку с заранее налитым трансформирующим раствором в количестве 5 мл, при этом кровь разводится в 251 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, оставляют стоять на 10 мин, а затем фотометрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 560нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор).

При тех же условиях обрабатывают и измеряют стандартный раствор с концентрацией гемоглобинцианида – 61,23 мг/100мл, что соответствует количеству гемоглобина в крови, равному 15,4 г/100мл при разведении ее в 251 раз.

Концентрация гемоглобина в крови (Гб, г%) вычисляется по формуле:

Гб = (Еоп/Ест)·С·К·0,001, где

Еоп – экстинция опытной пробы;

Ест – экстинция стандартного раствора;

С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%;

К – кратность разведения крови;

0,001 – коэффециент для пересчета мг/100 в г/100мл.

Одновременно берут 0,02мл крови в пробирку, в которую предварительно наливают 4 мл 1% раствора хлорида натрия (кровь разводится в 200 раз). Содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета.

Счетную камеру подготавливают следующим образом. Камеру с сеткой и покровное стекло насухо протирают. Затем покровное стекло прижимают к камере с такой силой, чтобы по краям его появились радужные полосы.

Перед заполнением счетной камеры разведенной кровью содержимое пробирки встряхивают. Затем стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно заполнила всю поверхность камеры с сеткой.

Эритроциты подсчитывают под малым увеличением (окуляр-7х, объектив-8х) в 5 больших (80 малых) квадратах сетки Горяева и вычисляют по формуле:

Эр=(А· С· 4000)/В, где

Эр — искомое число эритроцитов;

А – сумма клеток, подсчитанных в малых квадратах сетки;

В – количество сосчитанных малых квадратов (80);

С – разведение крови (в 200 раз)

4000 – множитель, приравнивающий объем малого квадрата (1/4000 мм3) к 1 мм3.

Для характеристики степени насыщаемости гемоглобином отдельного эритроцита определяют так называемый цветовой показатель (ЦП) по следующей формуле:

ЦП=(Гб· 3)/Эр, где

Гб – концентрация гемоглобина (в г%);

Эр – первые две цифры (сотни тысяч) эритроцитов;

3 – постоянный коэффициент.

Параллельно оценивают количество ретикулоцитов в крови. Для этого на предварительно окрашенное краской (бриллиант-крезолблау) предметное стекло помещают каплю исследуемой крови и делают мазок обычным способом. Препарат помещают во влажную камеру на 8-10 минут, затем высушивают его и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа (окуляр-15х, объектив – 90х).

Подсчитывают 1000 эритроцитов и определяют среди них процентное содержание ретикулоцитов (ретикулоциты отличаются от окрашенных в зеленый цвет эритроцитов наличием в цитоплазме синих зерен или сетки). Для облегчения подсчета эритроцитов из бумаги вырезают кружок, соответствующий диаметру окуляра микроскопа. В центре кружка проделывают небольшое четырехстороннее отверстие и вставляют в оптическую систему окуляра.

Работа №2. Изучение показателей красной крови при экспериментальной постгеморрагической анемии.

Материальное оснащение:

1.Животные: кролик с постгеморрагической анемией — 1 шт.

Остальное см. в работе №1.

Методика проведения опыта:

У кролика за 2 дня до занятия выпускают 40-50% крови, вследствие чего развивается острая постгеморрагическая анемия.

В день занятий в крови, взятой из краевой вены, определяют концентрацию гемоглобина, подсчитывают число эритроцитов и ретикулоцитов, вычисляют цветовой показатель (способы оценки указанных параметров крови см. в работе №1).

Результаты, полученные в работах 1 и 2, сопоставляют и анализируют. В заключении обсуждают механизмы развития постгеморрагической и гемолитической анемий.

Работа №3. Характеристика клеточного состава крови больных с различными видами анемий.

Материальное оснащение.

1.Мазки крови больных:

с постгеморрагической анемией — 2 шт.

с гемолитической анемией — 2 шт.

с В12 – дефицитной анемией — 2 шт.

2.Микроскоп — 1 шт.

3.Иммерсионное масло в масленке — 10 мл.

Ход анализа.

Под иммерсионной системой микроскопа (окуляр – 15х, объектив – 90х) изучают готовые мазки крови больных с указанными анемиями. Обращают внимание на патологические формы эритроцитов (анизо-, пойкилоцитоз; мегалобластический тип гемопоэза и др.). Обнаруженные в мазках крови измененные эритроциты зарисовывают в тетрадях. Делают выводы по проделанной работе.

Работа № 4. Оценка осмотической резистентности эритроцитов при постгеморрагической и гемолитической анемиях у кроликов.

Материальное оснащение:

1.Пробирки простые — 27 шт.

2.Штативы на 10 гнезд — 3 шт.

3.Пипетки на 1 мл. — 3 шт.

4.Пипетки на 2 мл. — 6 шт.

5.Игла от шприца для прокола вены — 3 шт.

6.Центрифуга лабораторная — 1 шт.

7.1% раствор хлорида натрия — 50 мл.

8.Дистиллированная вода — 50 мл.

9.Гепарин — 1 мл.

10. Животные: кролик с постгеморрагической

анемией — 1 шт.

кролик с гемолитической анемией — 1 шт.

кролик контрольный — 1 шт.

Методика проведения опыта.

Способы моделирования постгеморрагической и гемолитической анемий см. в работах 1 и 2.

В день занятия из краевой вены кролика после прокола иглой берут 2-3 мл крови с двумя каплями гепарина. Содержимое пробирки сразу же перемешивают для предотвращения образования сгустков крови и центрифугируют 10 минут при 2000 об/мин. Для анализа используют эритроцитарную массу.

Из 1 % раствора хлорида натрия готовят ряд разведений (табл.1).

Таблица 1

Максимальная осмотическая резистентность эритроцитов определяется в той первой пробирке, в которой наблюдается полный гемолиз. Минимальная осмотическая резистентность эритроцитов регистрируется после центрифугирования пробирки ( при 1000 об/мин. в течение 5 минут), содержащей супернатант со следами гемолиза ( розовый оттенок надосадочной жидкости).

В норме:

минимальная осмотическая резистентность эритроцитов – 0,46- 0,48% раствор хлорида натрия;

максимальная осмотическая резистентность эритроцитов – 0,28 -0,32 % раствор хлорида натрия.

В данной работе исследуют кровь опытных и контрольного кроликов. Полученные результаты сопоставляют и анализируют.

В заключении обсуждают возможные механизмы нарушения физико-химических свойств эритроцитов при изученных анемиях.

Работа № 5. Характеристика скорости оседания эритроцитов при развитии острого воспалительного процесса.

Материальное оснащение.

1.Капилляр Панченкова — 5 шт.

2.Штатив Панченкова — 1 шт.

3.Лезвие для безопасной бритвы — 1 шт.

4.Часовое стекло — 1 шт.

5.Стеклянная палочка в стакане — 1 шт.

6.Стакан с ватой — 1 шт.

7.5% раствор трехзамещенного цитрата натрия — 10 мл.

8.Этиловый спирт (960) — 10 мл.

9.Животные: крысы с воспалительной реакцией — 2 шт.

крыса интактная — 1 шт.

Методика проведения опыта.

Эксперимент ставят на двух крысах. За двое суток до занятия одной из них вводят в брюшную полость 7- 8 мл стерильного мясопептонного бульона, а другой — подкожно 0,5 мл скипидара. В обоих случаях развивается регионарное асептическое воспаление.

На занятии у опытной и контрольной (интактной) крыс определяют скорость оседания эритроцитов. Для этого капилляр Панченкова промывают раствором цитрата натрия. Затем цитрат натрия набирают до метки “P” (¼ полного объема капилляра) и вдувают его на часовое стекло.

После надреза боковой поверхности корня хвоста животного в капилляр Панченкова набирают кровь до метки “K” (полный объем капилляра). Кровь переносят на часовое стекло и тщательно перемешивают его с цитратом стеклянной палочкой. В результате получается разведение крови в цитрате в соотношении 4:1. Затем цитратную кровь набирают в капилляр до метки “K” и ставят в штатив Панченкова. Через 1 час регистрируют СОЭ по высоте отстоявшегося слоя плазмы в мм (мм/ч).

Результаты опытов сопоставляют с контролем. В заключении обсуждают вероятные механизмы изменения СОЭ при воспалительной реакции.

Работа №6. Решение ситуационных задач по теме.