Инфекционный бронхит кур лабораторная диагностика

Ðàçìåùåíî íà https://www.allbest.ru/

6

Ðàçìåùåíî íà https://www.allbest.ru/

Ëàáîðàòîðíàÿ äèàãíîñòèêà èíôåêöèîííîãî áðîíõèòà

èíôåêöèîííûé ïðîôèëàêòèêà êóðèöà áðîíõèò

Èíôåêöèîííûé áðîíõèò (ÈÁÊ) — âèðóñíîå êîíòàãèîçíîå çàáîëåâàíèå, ïîðàæàþùåå êóð, ïðîÿâëÿåòñÿ ó ìîëîäíÿêà — ðåñïèðàòîðíûì è óðåìè÷åñêèì ñèíäðîìàìè, à ó êóð — ïîðàæåíèåì ãåðìèíàòèâíûõ îðãàíîâ, ÷òî âåäåò ê äëèòåëüíîìó ñíèæåíèþ ÿéöåíîñêîñòè. Ïðîòåêàåò â 3 ôîðìàõ: ðåñïèðàòîðíîé, íåôðîçî-íåôðèòíîé, ðåïðîäóêòèâíîé.

Ñâîéñòâà âèðóñà

Order: Nidovirales, ñåìåéñòâî êîðîíàâèðóñîâ (F. Coronaviridae), ïîäñåìåéñòâî Coronavirinae, ðîä Gammacoronavirus.

· ñòðóêòóðà: ðàçìåð -80 — 160 íì, ôîðìà — îêðóãëàÿ, íóêëåîêàïñèä â âèäå áóáëèêà, òèï ñèììåòðèè — ñïèðàëüíûé, ñóïåðêàïñèä, íà êîòîðîì áóëàâîâèäíûå «âûñòóïû».

· ãåíîì: îäíîöåïî÷å÷íàÿ ÐÍÊ «+» íèòü, èíôåêöèîííà.

· Óñòîé÷èâîñòü — ñëàáàÿ â ùåëî÷íîé ñðåäå, íî ðåçèñòåíòíûå ê êèñëîé (ðÍ — 3). Ò — 560Ñ — 10 ìèí., Ò — — 300Ñ — 17 ëåò.

· Ðåïðîäóêöèÿ — ïðîèñõîäèò â öèòîïëàçìå, êóäà âèðóñû ïðîíèêàþò ïîñðåäñòâîì ýíäîöèòîçà. Ðåïëèêàöèÿ îñóùåñòâëÿåòñÿ ÷åðåç ñóáãåíîìíûå ÐÍÊ, êîòîðûå íóæíû äëÿ òðàíñëÿöèè áåëêà Ì. «+» íèòü áåç òðàíñêðèïöèè ïðèñòóïàåò ê òðàíñëÿöèè è îáðàçîâàíèþ áåëêà ïîëèïðîòåèíà, êîòîðûé çàòåì íàðåçàåòñÿ ñ ïîìîùüþ ôåðìåíòîâ — ïðîòåàç íà ìàëåíüêèå ó÷àñòêè äëÿ ïðîÿâëåíèÿ èõ èíôåêöèîííîñòè. Ñáîðêà è âûõîä âèðóñà èç êëåòêè ïóòåì ïî÷êîâàíèÿ.

· ÀÃ âàðèàáåëüíîñòü, ðîäñòâî: ñóùåñòâóåò Àã è èììóíîãåííàÿ âàðèàáåëüíîñòü øòàììîâ — îêîëî 30 ñåðîòèïîâ.

· ÃÀ ñâîéñòâà: ýðèòðîöèòû ïòèö ïîñëå îáðàáîòêè ôåðìåíòàìè.

Êëèíè÷åñêàÿ êàðòèíà

Èíêóáàöèîííûé ïåðèîä ïðîäîëæàåòñÿ îò 1 äî 5 äíåé. Ó áîëüíîé ïòèöû îòìå÷àåòñÿ óãíåòåíèå, âíåçàïíàÿ ïîòåðÿ àïïåòèòà, îäûøêà, õðèïû, êàøåëü, ÷èõàíèå, ñåðîçíûé êîíúþíêòèâèò, ðèíèò. Âûñîêàÿ çàáîëåâàåìîñòü, ñìåðòíîñòü äîñòèãàåò 25%. Çàðàæåíèå â âîçðàñòå äî 2-õ íåäåëü ïðèâîäèò ê çàäåðæêå ðîñòà ÿè÷íèêà è ÿéöåâîäà. Ïðè çàðàæåíèè âçðîñëûõ êóð ïðîèñõîäèò ðåçêîå ïàäåíèå ÿè÷íîé ïðîäóêòèâíîñòè íà 35-50%, ÿéöà ñ âîäÿíèñòûì ñîäåðæèìûì, íàðóøåííîé ñêîðëóïîé. Ïðè èíôàíòèëèçìå ÿè÷íèêà è ÿéöåâîäà íàðóøàåòñÿ ôîðìèðîâàíèå ÿèö. Ïåðåíîñ âîçìîæåí àýðîãåííî ïðè êîíòàêòå, òðàíñîâàðèàëüíî. Ïåðåáîëåâøàÿ ïòèöà îñòà¸òñÿ íîñèòåëåì âèðóñà äî 50-100 äíåé ïîñëå çàðàæåíèÿ. Íàáëþäàåòñÿ è ëàòåíòíîå òå÷åíèå èíôåêöèè, êîòîðîå îñëîæíÿåòñÿ çà ñ÷¸ò âîçáóäèòåëåé êîëèáàêòåðèîçà, ðåñïèðàòîðíîãî ìèêîïëàçìîçà.

Îòáîð ìàòåðèàëà äëÿ èññëåäîâàíèÿ. Äëÿ èññëåäîâàíèé îò áîëüíîé ïòèöû áåðóò ñìûâû ñ ãîðòàíè è òðàõåè âî âðåìÿ èíêóáàöèîííîãî ïåðèîäà èëè ïðîÿâëåíèÿ ÿðêèõ êëèíè÷åñêèõ ïðèçíàêîâ. Îò âûíóæäåííî óáèòûõ èëè òîëüêî ÷òî ïàâøèõ ïòèö áåðóò êóñî÷êè ëåãêèõ, ïî÷åê, ñîñêîáû òðàõåè, ãîðòàíè, áðîíõîâ, îò âçðîñëîé ïòèöû — ïî÷êè è ÿéöåâîäû.  ïåðèîä îñòðîãî òå÷åíèÿ áîëåçíè âèðóñ ìîæåò áûòü âûäåëåí èç ÿèö. Èñïûòóåìûé ìàòåðèàë äî èññëåäîâàíèÿ ìîæíî õðàíèòü ïðè òåìïåðàòóðå -20-700Ñ â òå÷åíèå íåäåëè. Èç îáðàçöîâ âçÿòîãî ìàòåðèàëà ãîòîâÿò 10%-íóþ ñóñïåíçèþ íà ðàñòâîðå Õåíêñà èëè èçîòîíè÷åñêîì áóôåðíîì ðàñòâîðå, öåíòðèôóãèðóþò 15 ìèí ïðè 2-3 òûñ. ìèí-1. Íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü îáðàáàòûâàþò àíòèáèîòèêàìè (2000 ÅÄ/ìë ïåíèöèëëèíà è 1 ìã/ìë ñòðåïòîìèöèíà), âûäåðæèâàþò 1,5 2 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå 40Ñ è èñïîëüçóþò äëÿ çàðàæåíèÿ ÷óâñòâèòåëüíîé ñèñòåìû (ÊÝ, êóëüòóðà êëåòîê ïî÷åê ÊÝ èëè ôèáðîáëàñòîâ öûïëÿò 10 — 25-äí âîçðàñòà). Òàêæå îòáèðàþò ïàðíûå ñûâîðîòêè êðîâè.

Íåïîñðåäñòâåííî ëàáîðàòîðíàÿ äèàãíîñòèêà.

Ýêñïðåññ ìåòîäû: ÐÈÔ (ð-ÿ èììóíîôëóîðåñöåíöèè), ÈÔÀ (èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç), ÌÃ (ìîëåêóëÿðíàÿ ãèáðèäèçàöèÿ íóêëåèíîâûõ êèñëîò), ÏÖÐ (ïîëèìåðàçíîöåïíàÿ ðåàêöèÿ).

Èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç (ÃÕ ÈÔÀ):

Êîìïîíåíòû ðåàêöèè:

· Ïðåïàðàò, ñîäåðæàùèé êëåòêè, èíôèöèðîâàííûå âèðóñîì

· Àöåòîí äëÿ ôèêñàöèè ïðåïàðàòà

· Íå ìå÷åííàÿ ñïåöèôè÷åñêàÿ ñûâîðîòêà

· ÀÒ 2-ãî ïîðÿäêà — àíòèâèäîâîé èììóíîïåðîêñèäàçíûé êîíúþãàò

· Ñóáñòðàò — 3,3 — ÄÀÁ — 4HCl

Õîä ïîñòàíîâêè ðåàêöèè:

· Ïðåïàðàò ôèêñèðóþò îõëàæäåííûì àöåòîíîì è âûñóøèâàþò íà âîçäóõå

· Íàíîñÿò ñïåöèôè÷åñêóþ ê èñêîìîìó âèðóñó ñûâîðîòêó

· Èíêóáèðóþò ïðè 370Ñ 1-2 ÷àñà âî âëàæíîé êàìåðå

· Ïðîìûâàþò ôèçèîëîãè÷åñêèì ðàñòâîðîì 5 ìèí è âûñóøèâàþò íà âîçäóõå

· Íàíîñÿò àíòèâèäîâîé èììóíîïåðîêñèäàçíûé êîíúþãàò â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè

· Èíêóáèðóþò ïðè 370Ñ 1-6 ÷àñîâ âî âëàæíîé êàìåðå

· Òùàòåëüíî ïðîìûâàþò ôèçèîëîãè÷åñêèì ðàñòâîðîì, ñïîëàñêèâàþò äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé è âûñóøèâàþò íà âîçäóõå

· Íàíîñÿò íåñêîëüêî êàïåëü ðàñòâîðà ñóáñòðàòà

· Èíêóáèðóþò 5-10 ìèí

· Ïðîìûâàþò ôèçèîëîãè÷åñêèì ðàñòâîðîì è ñïîëàñêèâàþò äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé

Ó÷åò ðåàêöèè:

Ïðîèçâîäÿò ñ ïîìîùüþ ñâåòîâîãî ìèêðîñêîïà. Äèàìèíîáåíçèäèíòåòðî-õëîðèä ïîä äåéñòâèåì ïèðîêñèäàçû ðàçëàãàåòñÿ, îáðàçóÿ ïðîäóêò ðåàêöèè ãîëóáîãî öâåòà, êîòîðûé áûñòðî ïåðåõîäèò â êîðè÷íåâûé.  ïðåïàðàòå âèäíû èëè äèôôóçíîå æåëòî-êîðè÷íåâîå îêðàøèâàíèå, èëè ãðàíóëû êîðè÷íåâîãî öâåòà â ìåñòàõ îáðàçîâàíèÿ êîìïëåêñà Àà — ÀÒ â êëåòêå.

Èçîëÿöèÿ âèðóñà.

1. ÊÝ 9 — 11 äíåé, çàðàæåíèå â àëëàíòîèñíóþ ïîëîñòü. ×åðåç 2 — 8 ñóòîê ãèáåëü; êàðëèêîâîñòü è ìóìèôèêàöèÿ çàðîäûøà, îò¸ê ÕÀÎ è àìíèîòè÷åñêîé îáîëî÷êè, èçìåíåíèå îáúåìà ýìáðèîíàëüíûõ æèäêîñòåé, ñìîðùèâàíèå æåë÷íîãî ìåøêà; ÐÃÀ.

2. îðãàííàÿ êóëüòóðà òðàõåè 19-äíåâíûõ ýìáðèîíîâ èëè çàðàæåííûõ öûïëÿò. ×åðåç 3 ñóòîê ïðåêðàùåíèå ïîäâèæíîñòè ðåñíèò÷àòîãî ýïèòåëèÿ ñëèçèñòîé îáîëî÷êè òðàõåè.

3. ÊÊ ïî÷åê, ëåãêèõ èëè ôèáðîáëàñòîâ êóðèíûõ ýìáðèîíîâ. ×åðåç 24 ÷àñà ÖÏÄ: ñèíöèòèè.

4. öûïëÿòà, çàðàæåííûå èíòðàòðàõåàëüíî. ×åðåç 1 — 2 ñóòîê ïðèçíàêè ïîðàæåíèÿ äûõàòåëüíûõ ïóòåé, âîçìîæíà ãèáåëü, ïàòîëîãîàíàòîìè÷åñêèå èçìåíåíèÿ.

Èäåíòèôèêàöèÿ âèðóñà. ÐÍ (ð-ÿ íåéòðàëèçàöèè), ÐÇÃÀ (ð-ÿ çàäåðæêè ãåìàããëþòèíàöèè), ÐÄÏ (ð-ÿ äèôôóçèîííîé ïðåöèïèòàöèè), ÐÈÔ (ð-ÿ èìóíîôëþîðåñöåíöèè), ÐÑÊ (ð-ÿ ñâÿçûâàíèÿ êîìïëåìåíòà), ÈÔÀ (èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç), ÝÌ, ÈÝÌ.

Ðåòðîñïåêòèâíàÿ äèàãíîñòèêà. ÐÍ (ð-ÿ íåéòðàëèçàöèè), ÐÇÃÀ (ð-ÿ çàäåðæêè ãåìàããëþòèíàöèè), ÐÍÃÀ (ð-ÿ íåïðÿìîé ãåìàããëþòèíàöèè), ÐÑÊ (ð-ÿ ñâÿçûâàíèÿ êîìïëåìåíòà), ÐÄÏ (ð-ÿ äèôôóçèîííîé ïðåöèïèòàöèè), ELISA

Äèôôåðåíöèàëüíàÿ äèàãíîñòèêà. Èíôåêöèîííûé ëàðèíãîòðàõåèò, Íüþêàñëñêàÿ áîëåçíü, ãðèïï, îñïà, èíôåêöèîííûé ðèíîòðàõåèò, ðåñïèðàòîðíûé ìèêîïëàçìîç, ãåìîôèë¸ç.

Èììóíèçàöèÿ. Ñïåöèôè÷åñêàÿ ïðîôèëàêòèêà îñíîâûâàåòñÿ íà ïðèìåíåíèè èíàêòèâèðîâàííîé è æèâîé âàêöèí. Ñóùåñòâóþò ìîíî è ïîëèâàëåíòíûå, àññîöèèðîâàííûå âàêöèíû.

Ïðèìåíåíèå èíàêòèâèðîâàííûõ âàêöèí.Äîñòàòî÷íî ýôôåêòèâíûì îêàçàëèñü ýìóëüãèðîâàííûå âàêöèíû èç êîíöåíòðèðîâàííîãî âèðóñà. Ââåäåíèå èíàêòèâèðîâàííîé âàêöèíû â 3 è 16-íåä âîçðàñòå äàëî òàêîé æå ýôôåêò, êàê è ïðèâèâêà æèâûìè âàêöèíàìè. Íàèáîëåå âûðàæåííûé èììóííûé îòâåò ó 100% öûïëÿò ïîëó÷åí ïðè âàêöèíàöèè â 3-íåä âîçðàñòå æèâîé âàêöèíîé èç øò. Í120, à â 16-íåä âîçðàñòå — èíàêòèâèðîâàííîé ýìóëüñèíâàêöèíîé. Ðåêîìåíäîâàíî ïðè êîíñòðóèðîâàíèè èíàêòèâèðîâàííûõ âàêöèí ïðîòèâ ÈÁ èñïîëüçîâàòü íåñêîëüêî øòàììîâ.

Ïðèìåíåíèå æèâûõ âàêöèí. Øòàììû, ïîëíîñòüþ óòðàòèâøèå âèðóëåíòíîñòü, ïðàêòè÷åñêè íåèììóíîãåííû. Ïîýòîìó æèâûå âàêöèíû ãîòîâÿò èç àòòåíóèðîâàííûõ øòàììîâ, îáëàäàþùèõ ðàçëè÷íîé ñòåïåíüþ îñòàòî÷íîé âèðóëåíòíîñòè. Äëÿ ïåðâîé ïðèâèâêè ïðèìåíÿþò áîëåå àòòåíóèðîâàííûå è ìåíåå èììóíîãåííûå øòàììû, äëÿ âòîðîé áîëåå âèðóëåíòíûå. Æèâûå âàêöèíû ïðèìåíÿþò îðàëüíî (ñ ïèòüåâîé âîäîé) èëè ïóòåì çàêàïûâàíèÿ â íîñ. Ââåäåíèå æèâîé âàêöèíû â çîá öûïëÿòàì ñîçäàâàëî óñòîé÷èâîñòü ê çàðàæåíèþ áåç îáðàçîâàíèÿ öèðêóëèðóþùèõ ÀÒ. Ýòè äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î âàæíîé ðîëè ìåñòíîãî èììóíèòåòà ïðè ÈÁ. Ìàòåðèíñêèå ÀÒ îò èììóííûõ êóð-íåñóøåê ïåðåäàþòñÿ ÷åðåç ÿéöî öûïëÿòàì, êîòîðûõ îíè çàùèùàþò â ïåðâûå 2 — 4 íåä æèçíè îò ÈÁ. Ïåðèîä ïîëóæèçíè ìàòåðèíñêèõ ÀÒ ñîñòàâëÿåò íåìíîãèì áîëåå 5 äí. Ñî âòîðîé íåäåëè æèçíè òèòð èõ íà÷èíàåò ñíèæàòüñÿ. Îïòèìàëüíûé âîçðàñò äëÿ âàêöèíàöèè öûïëÿò æèâûìè âàêöèíàìè ñîñòàâëÿåò 2-3 íåä.

Ñîòðóäíèêàìè ÂÍÈÂÈÏ ñîçäàíà æèâàÿ âàêöèíà èç àòòåíóèðîâàííîãî øòàììà ÂÈÁ.  íåáëàãîïîëó÷íûõ ïóíêòàõ èììóíèçèðóþò âñåõ öûïëÿò â 10 — 15-äí âîçðàñòå 2-êðàòíî ÷åðåç 14 — 15 äí. Ðåâàêöèíèðóþò ïòèö â 100 — 120-äí âîçðàñòå.

Ïðè îöåíêå ðàçëè÷íûõ ïðîãðàìì âàêöèíàöèè ïðîòèâ ÈÁ â êîìïàíèè Ïèòìåí Ìîîð ñðàâíèâàëè òèòðû ÀÒ â ÐÇÃÀ è ÐÍ. Öûïëÿò ïåðâûé ðàç èììóíèçèðîâàííûõ â âîçðàñòå ðàçëè÷íûìè æèâûìè âàêöèíàìè, à ïîâòîðíî â 16-íåä âîçðàñòå èíàêòèâèðîâàííûìè àäúþâàíò âàêöèíàìè èç øò. Ì41 èëè GV101.  èòîãå óñòàíîâëåíî, ÷òî óðîâåíü ÀÒ ó ïðèâèòûõ öûïëÿò áûë âûøå ê âèðóñó Ì41 è ðåâàêöèíèðîâàííûõ óáèòîé âàêöèíîé èç äâóõ øòàììîâ, èìåëèñü áîëåå âûñîêèå òèòðû ÀÒ ê ñåðîòèïàì Ìàññà÷óñåòå è Ä207. Àòòåíóèðîâàííûå âàêöèííûå øò. Ìàññà÷óñåòå 33 è Í120 ïåðñèñòèðóþò â òðàõåå è ëåãêèõ ñ 3 äî 13 äí ïîñëå âàêöèíàöèè.

Èäåíòèôèêàöèþ âèðóñà ïðîâîäÿò ïðè ïîìîùè ÐÍ, ÐÄÏ, ÐÇÃÀ, ÐÑÊ, ÐÍÃÀ, ÐÈÔ è äð. ÐÍ è ÐÍÃÀ — òèïîñïåöèôè÷åñêèå è èñïîëüçóþòñÿ ïðè îïðåäåëåíèè ñåðîëîãè÷åñêîãî òèïà âèðóñà. ÐÄÏ è ÐÍÃÀ èäåíòèôèöèðóþò âèðóñ áåç âûÿâëåíèÿ òèïîâîé ïðèíàäëåæíîñòè. ÐÑÊ óñòàíàâëèâàåò øòàììîñïåöèôè÷íîñòü â ïðåäåëàõ îäíîãî Àà òèïà.

Ðàçìåùåíî íà Allbest.ru

ГОСУДАРСТВЕННА й СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

птица сельскохозяйственна

Методы лабораторно диагностики инфекционного бронхита

Agricultural pouitry Methods of laboratory diagnostics of infectious bronchitis

ГОСТ

25583-83

(CT СЭВ 1744—79)

«°оС,ТаНО“Ле»Ием ГосУДаРетвеннЪго комитета СССР по стандартам от 6 января 1983 г. № 18 срок действия устацовлен

с 01.07.83 до 01.07.88

Несоблюдение Стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на кур и устанавливает методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы в лабораториях ветерина|)НЫХ научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1744—79.

1. Методы ОТБОРА ПРОБ

1.1. Для вирусологичес^ого исследования берут пробы тканей и органов — трахеи, слизистой оболочки носовой полости, почек и легких убитой или только ЧХо павшей птицы, а от взрослой птицы — почек и яйцеводов.

1.2. Для серологическое исследования берут не менее чем от 10 голов птицы^ дважды с интервалом 14—21 сут пробы крови по 5 см3 от каждой птицы. Отстаивают сыворотку крови.

1.3. Пробы органов и T^aHeg Или их 10%-ную суспензию хранят при температуре минус 20°С. Пробы сыворотки крови хранят без добавления консервантов при температуре минус 20°С.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Вирусологический метод

Сущность метода заключается в изолировании и идентификации возбудителя заболевания на куриных эмбрионах или на культура кглггеги:

Издание официальное Перепечатка воспрещена

2.1.1. Аппаратура и материалы

Для проведения исследования применяют: термостат с температурой нагрева 37—38°С; инкубатор; ступки фарфоровые;

центрифугу с частотой вращения 3000 об/мин; пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 10515—75; овоскоп;

шприцы с иглами;

куриные эмбрионы 9-суточного возраста;

культуру клеток почек куриных эмбрионов или фибробласты; раствор Хенкса; стрептомицин, пенициллин.

2.1.2. Подготовка к исследованию

Пробы органов и тканей растирают в стерильной ступке в изотоническом буферном растворе в соотношении 1 : 10 и экстрагируют в течение 2 ч при 4°С. Суспензию центрифугируют с частотой вращения от 1500 до 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают 2000 ЕД/см3 пенициллина и 2 ЕД/см3 стрептомицина.

2.1.3. Проведение исследования

Обработанную антибиотиками надосадочную жидкость иноку-лируют в дозе 0,2 см3 через воздушную камеру в аллантоисную полость шести куриным эмбрионам 9-суточного возраста.

Зараженные эмбрионы инкубируют при 37,5°С и относительной влажности 60—70% и два раза в день овоскопируют. Эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после заражения, не учитывают. Оставшихся в течение 72 ч трех живых эмбрионов убивают охлаждением при температуре 4°С, а остальных собирают и охлаждают через 7 сут после заражения. От первых трех эмбрионов собирают аллантоисную жидкость и хориоаллантоисную оболочку для следующего пассажа, а остальные эмбрионы исследуют на наличие макроскопических изменений.

Проводят четыре последовательных пассажа, вируса на куриных эмбрионах, так как первый пассаж в большинстве случаев не вызывает гибели или изменения эмбрионов.

Идентификацию вируса проводят на 9-суточных куриных эмбрионах в реакции нейтрализации (PH), используя известные специфические антисыворотки как минимум к двум основным серотипам вируса (Massachusets, Connecticut) с индексом нейтрализации антисывороток более 3 lg (см. п. 2.2.3.1), или в реакции нейтрализации в культуре клеток почек куриных эмбрионов или фибробластов (см. п. 2.2.3.2).

2.1.4. Обработка результатов

2.1.4.1. Вирус считают идентифицированным и результат положительным, если эмбрионы, инокулированные смесью испытываемого вируса со специфической антисывороткой, остаются живыми и развиваются нормально, а эмбрионы, инокулированные только испытываемым вирусом, погибают или отстают в развитии; у эмбрионов наблюдается перекручивание тела, сворачивание тела в шар, уменьшается количество амниотической жидкости, оболочки плотно прилегают к эмбриону.

В культуре клеток при положительной реакции специфическая антисыворотка ингибирует цитопатический эффект, вызванный вирусом инфекционного бронхита.

2.1.4.2. При получении отрицательного результата в реакции нейтрализации (это может быть связано с неспецифичностью используемой антисыворотки к присутствующему серотипу вируса— Massachusets, Connecticut) проводят реакцию преципитации в агаровом геле (РПАГ) по п. 2.2.3.3.

2.2. Серологический метод

Сущность метода заключается в выявлении у переболевшей птицы специфических антител в реакции нейтрализации (PH) и реакции преципитации в агаровом геле (РПАГ).

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения исследования применяют: баню водяную;

термостат с температурой нагрева 37—38°С; центрифугу с частотой вращения 3000 об/мин; пробирки вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 25336—82; пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 20292_74-

чашки Петри по ГОСТ 25336—82;

штамп для изготовления лунок в агаре;

воронку по ГОСТ 25336—82;

пенициллин;

стрептомицин;

агар очищенный;

мединал;

куриные эмбрионы 9-суточного возраста;

культуры клеток почек куриных эмбрионов, выращенные на среде с 10%-ной телячьей сывороткой;

среды питательные для культуры клеток;

антисыворотки типоспецифические к инфекционному бронхиту, положительные;

штаммы эталонные вирусов инфекционного бронхита разных антигенных типов;

натрий хлористый по ГОСТ 4233—77, 0,87%-ный растввр; воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

2.2.2. Подготовка к исследованию

Пробы сыворотки крови инактивируют прогреванием при температуре 5б°С в течение 30 мин. Загрязненную сыворотку фильтруют через бактериальные фильтры или обрабатывают антибиотиками.

2.2.3. Проведение исследования в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах

2.2.3.1. В реакции используют вирус с титром не ниже 107 ЭИД 50/1 см3. Готовят серийные десятикратные разведения вируса от 10_3 до 10-8. Равные количества разведенного вируса, специфических антисывороток и испытываемых сывороток крови смешивают и смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

Каждым разведением инокулируют по четыре куриных эмбриона 9-суточного возраста в аллантоисную полость в дозе 0,2 см3. Инокулированные куриные эмбрионы овоскопируют ежедневно в течение 3—8 сут (в зависимости от используемого штамма); погибшие эмбрионы в течение первых 24 ч не учитывают.

2.2.3.2. Обработка результатов

По истечении 3—8 сут определяют инфекционный статус каждой группы инокулированных куриных эмбрионов и вычисляют ИД50. Разница между логарифмами титра контрольного ряда вируса и титра смеси вируса с испытываемой сывороткой выражает индекс нейтрализации.

При значениях индекса нейтрализации от 0,0 до 1,0 результат реакции считают отрицательным, от 1,1 до 2,0 — сомнительным, от 2,1 и выше — положительным.

Если для 20 и более процентов испытываемых сывороток крови получится сомнительный результат, исследование проводят в реакции преципитации в агаровом геле. При получении сомнительных результатов проводят исследование сывороток крови, полученных при повторном взятии крови от птицы на 14—21 сут. Вируснейтрализующие антитела образуются через 2—3 недели после вспышки заболевания и сохраняются пожизненно, а преци-питирующие антитела — от 2 до 7 недель после начала заражения.

2.2.4. Проведение исследования в реакции нейтрализации на культурах клеток

2.2.4.1. Берут свежеполученную культуру клеток при образовании сплошного монослоя и адаптированный к культурам клеток вирус с титром 5—5,5 ед/см3.

Готовят серийные 10-кратные разведения вируса до 10-6. Каждое разведение вируса смешивают с равным количеством типоспецифической сыворотки. Если в реакции используются кроличьи контрольные сыворотки (положительная и отрицательная), их разводят до 10”1, так как неразведенные сыворотки вызывают неспе

цифическое гранулирование цитоплазмы клетки. Разведение сыворотки учитывают при вычислении индекса нейтрализации. Для каждого разведения вируса и смеси вируса с сывороткой берут по четыре пробирки. Разведения вируса и смеси вируса с сывороткой вносят в каждую пробирку в объеме 0,1 см3, адсорбируют в течение 30—40 мин при комнатной температуре, а затем добавляют поддерживающую среду в объеме 0,9 см3, содержащую 2,5% телячьей сыворотки, и инкубируют при 37,5°С в течение 6 сут.

2.2.4.2. Обработка результатов

Учет реакции ведут по цитопатическому действию вируса. Разница логарифмов титра вируса и смеси вируса с сывороткой считается индексом нейтрализации. Результат реакции определяют по п. 2.2.3.2.

2.2.5. Проведение исследования в реакции преципитации в агаровом геле

2.2.5.1. Очищенный агар от 1,1 до 1,5%, содержащий 8% хлористого натрия и имеющий pH 7,6—7,8, наливают в чашки Петри. Штампом делают лунки (углубления) диаметром 4 или 6 мм на расстоянии 4 мм друг от друга. На дно каждой лунки наносят каплю расплавленного агара; антиген получают из гомогенезирозан-ных хориоаллантоисных оболочек (ХАО) погибших куриных эмбрионов, инокулированных адаптированным к ним штаммом. Выбирают только те ХАО, которые показывают четкую и сильно выраженную реакцию с преципитирующей специфической антисывороткой; сыворотки — контрольные (положительная и отрицательная) и испытуемые должны быть в нативном состоянии и не инактивированными. Чашки Петри выдерживают во влажной камере при температуре 37°С или при комнатной температуре в течение 24—72 ч.

Кроме контрольной положительной и отрицательной сывороток, в РПАГ ставят и контроль на антиген, изготовленный из гомогената ХАО незараженных куриных эмбрионов того же самого возраста.

2.2.5.2. Обработка результатов

Появление линии преципитации между антигеном и сыворотками свидетельствует о положительном результате.

Небольшой процент положительных результатов в реакции преципитации в агаровом геле выявляют в том случае, если заражение птиц происходило за 2—7 недель до исследования.

Если устанавливают большой процент преципитирующих сывороток, стадо птицы считают неблагополучным по инфекционному бронхиту.

Изменение № 1 ГОСТ 25583—83 Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита

Утверждено и введено в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 17.03.88 № 596

Дата введения 01.07.88

Под наименованием стандарта проставить код: ОКСТУ 9809.

По всему тексту стандарта заменить единицу: об/мин на мин-1.

Пункт 2.1.1. Заменить ссылку: ГОСТ 10515—75 На ГОСТ 25336—82. Пункт 2.1.2. Заменить слова: «изотоническом буферном» на «физиологическом», «Надосадочную жидкость обрабатывают 2000 ЕД/см3 пенициллина и 2 ЕД/см3 стрептомицина» на «В надосадочную жидкость добавляют 2000 ЕД/ см3 пенициллина и 2 мг/см3 стремтомицина, выдергивают при комнатной температуре 1 ч и делают высевы на питательные средь^э.

Пункт 2.1.3. Третий абзац. Заменить слово: «четыре» на «шесть».

(Продолжение см. с. 350}

Пункт 2.1.4.2 исключить.

Пункт 2.2.1. Двенадцатый абзац дополнить словами: «или Пункт 2.2.5.1. Первый абзац после слов «Очищенный агар» «или агар Дифко».

(ИУО Mb б 1988 г.)

агар Дифко». дополнить ело-